1927年3月21 日，上海第三次工人起義爆發，當時北伐軍已占領龍華，在北伐軍薛嶽部的支持下，工人武裝占領了除租界以外的整個上海。鑒於在上海工人中的號召力，和共產國際執委會第七次擴大會議的要求，陳獨秀等中共領導人公開打出自己的旗幟，積極籌組上海特別市臨時政府。
3 月26 日，蔣介石到達上海，形勢驟然緊張。4 月1 日，汪精衛自國外翩然歸來，陳獨秀遵照共產國際的指示，與汪精衛發表《國共兩黨領袖汪兆銘、陳獨秀聯合宣言》，稱：
“有人說國民黨領袖將要驅逐共產黨，將壓迫工會和糾察隊，這種謠言不知從什麽人嘴裏傳開？國民黨最高黨部最近召開會議，聲明決無摧殘共產黨和工會的事，並要求革命人民不要聽信任何謠言……”
但“汪陳宣言”發表6 天後，蔣介石即發動了“四一二”反革命政變，隨後在南京另立政府。
而汪精衛到武漢就任國民政府常務委員會主席後，發現武漢政府麵臨的困境遠比他想象的要嚴重得多。
首先軍隊中已經出現嚴重狀況，唐生智軍隊裏的軍官大多來自湖南，他們反對農民奪取他們的土地和財產。商務部長宋子文原是讚成開展工農運動的，但他需要穩定財政狀況，加強稅收，這不僅與工農運動相矛盾，更會觸及一些工人的過高要求。在稅收直線下滑的情況下，同時因為一些工人對他恨之入骨，他離開武漢，溜之大吉。
陳獨秀一行到達武漢後，汪精衛與譚延闓立刻會晤陳獨秀，對工農運動完全不受國民黨控製頗多微詞，要求無論任何問題，共產黨都應與國民黨共同討論，保持協調一致。當陳獨秀將這次談話內容告訴張國燾的時候，張國燾說：“我們都知道運動有些失控，但我們沒有那麽多幹部去做疏導工作。何況新來的共產國際代表團負責人羅易，他的主張顯然比現實要激進得多。”
“好在鮑羅廷同意對工農運動過激行動做進一步約束。”陳獨秀表示。
但事實上，到4 至5 月中共“五大”召開前後，中共中央已發過不少文件對工農運動進行約束，卻毫無效果。
北伐以來，基層黨組織迅速擴大，大批新黨員缺少基本培訓，對相關理論、政策方麵的知識知之甚少；而中央與地方工作難以溝通與銜接，下級各行其是；部分工會、農會受地方幫會控製，莫說約束、領導武漢以外地區的工農運動，就是武漢地區的狀況也難以控製。
然而，共產國際過高地估計了中共控製工農運動和左右國民黨的能力，莫斯科嚴詞電令陳獨秀與鮑羅廷：“在共產黨的積極參與下由農民實際沒收土地”，“沒收土地的口號對於被強大的土地運動席卷的省份，如湖南、廣東等省是非常及時的。舍此便不可能開展土地革命。”與此同時，要求他們“現在就應開始組建8個或10個由革命的農民和工人組成的、擁有絕對可靠的指揮人員的師團，不得拖延。”
莫斯科的指示無異於紙上談兵，在中共缺乏資金、武器、可靠的指揮人員的情況下，加之武漢國民政府的將軍們已經對中共無比仇視，迅速組建8個或10 個師團絕無可能。
但在共產國際代表團的監督指導下，中共“五大”做出了一些相當激進的決議，如《土地問題議決案》宣稱：“共產黨將領導農民從事於平均地權的鬥爭，向著土地國有、取消土地私有製度的方向，而努力進行。”
然而“五大”一結束，汪精衛便再度找到陳獨秀，對共產黨人的行為提出質疑與譴責，其中包括：
共產黨人擅自提出“打倒蔣介石”的口號，國民黨對此一無所知；在共產黨人的宣傳鼓動下，發生了1927 年初占領英國租界的事件；蘇聯在唆使中國人民同帝國主義作鬥爭，並在這一鬥爭中作殘酷的自我犧牲，但是蘇聯自己卻不積極參與這種鬥爭；存在兩個黨組織是不合適的，如果領導權屬於國民黨左派，那就不需要共產黨；如果領導權在共產黨人手裏，那就不需要國民黨。
接著，5 月21 日晚發生了“馬日事變”，國民黨軍官許克祥部在長沙查封了工會、農會，解除了工人糾察隊、農民自衛軍武裝，並通電斥責工農運動。事變發生後，湖南各地紛紛效仿，其中有湘潭、衡陽、武岡、益陽、湘陰、桃源、永州、瀏陽、臨湘、安鄉、辰州、敘浦等地。27日，許克祥等人在長沙成立了“中國國民黨湖南救黨委員會”，通令改組各級黨部，迅速控製了湖南大部分地區。
“馬日事變”發生後，陳獨秀、鮑羅廷與新來的共產國際代表羅易發生衝突，鮑羅廷堅持派代表赴長沙與許克祥等人進行和平調解，並製止湖南工農過激行為，平息軍人怒火。
陳獨秀在5 月23 日的聯席會議上指出：許克祥部的第二、第八、第三十五、第三十六軍都是湖南的軍隊，軍官們收到的來自家鄉的都是壞消息，諸如家屬被農協戴高帽遊鄉、被批鬥被逮捕，土地被沒收，財產被瓜分等。
在這個情況下軍官們就要鎮壓農民運動，而農民們想要平分土地，平分房屋等。因此，我們需要作出讓步，就是目前情況下暫時不提出土地問題。這樣做為了有時間“準備我們自己的軍事力量”，以便有朝一日將那些不可靠的將軍打倒。
對此，共產國際於6月2日發出了著名的“五月指示”，在這個指示中，共產國際雖肯定了工農運動存在“過火”，同意約束過火行為，但仍然堅持不得妨礙土地革命，不得妨礙建立新軍，尤其過高地估計共產黨在國民黨中央的作用，一廂情願地堅持在不破裂兩黨關係的情況下，馬上組織共產黨自己的軍隊，改組國民黨中央，依靠汪精衛等國民黨左派，開展土地革命，使武漢政府革命化。
對共產國際完全脫離實際的指示，陳獨秀既氣憤又無可奈何。
就在此時，江西省主席朱培德以“製止過火的工農運動”為借口，武裝遞解共產黨員全體出境，同時查封全省工會、農會、學生會。
在這一形勢下，在討論莫斯科來電的專門會議上，陳獨秀對“五月指示”提出不同意見，認為莫斯科不了解中國的實際情況，“農民運動引起的過火行為（破壞了） 同地主、紳士和軍官的統一戰線。過火行為也妨礙了土地問題的解決。”必須“先糾正過火行為，然後采取解決土地問題的進攻性措施。”
對於改組國民黨中央，陳獨秀稱：“國民黨的領導是在黨的代表大會上選舉產生的，現在我們怎麽能改變它呢？”
對於組建新軍，陳獨秀認為此時中共沒有這個能力。最後，陳獨秀說：“我們衷心讚同指示，但問題是我們黨未必能夠貫徹執行”。
羅易對陳獨秀的態度表現出極大的憤慨，指責陳獨秀是“國民黨在共產黨內的代理人”，揚言“應當把陳獨秀清除出共產黨領導機構”。
6 月26 日，在中央政治局與共產國際代表團召開的最後一次聯席會議上，陳獨秀直言不諱地說：
“我們有兩條道路，一條是右的，一條是左的。右的一條是放棄一切，左的一條是反對一切。走這兩條道路我們都將垮台。還有一條中間道路，就是把目前的狀況繼續下去，然而這也是不可能的。”“如果我們想在政治上獨立自主，我們就應當退出國民黨。”
陳獨秀的倡言顯然與共產國際的指示背道而馳，自然會遭到與會者的反對。
6月28 日，第三十五軍軍長何健發表通電，要求武漢國民黨中央和唐生智“明令與共產黨分離”。至此，一切趨勢表明，倘使共產黨不主動退出國民黨，很快會遭遇被驅逐的命運。
6 月底，眼見武漢政權陷入危機，國共兩黨破裂在即，莫斯科突然緊張起來，不僅給中共發電打氣，而且大筆匯款，稱要通過武裝工農，組建新軍，“挽救革命”。然而直到這時，莫斯科仍舊堅持共產黨“必須在國民黨內”，給陳獨秀與鮑羅廷的電報中明確指出：必須“使國民黨民主化並讓它領導群眾性革命運動”。
為避免寧漢合流，莫斯科甚至決定匯給汪精衛數百萬盧布。
對莫斯科的一廂情願，陳獨秀哭笑不得。他已經對共產國際不再報什麽希望，從6月中旬便開始為國共關係破裂做準備，全力部署恢複湖南黨組織的工作，組織農民自衛軍對許克祥部進行反擊，開展抗租運動。對敵軍，他主張“大隊來則避，小則與之打”。實在站不住腳的話，他讚成毛澤東的提議，上山。
可是，陳獨秀沒來得及做更多的部署，便已經無法繼續工作下去了。
7 月5 日，陳獨秀參加了最後一次中央政治局常委會議。鑒於“上麵國際責難，下麵同誌非難”，尤其適應不了莫斯科的思維方式，陳獨秀做出了辭職的選擇，於7月12 日離開了他為之嘔心瀝血操勞6年之久的中共中央。
7月15 日，武漢汪精衛政府宣布“分共”，從此寧漢合流。