1927年，蔣介石在上海發動“4·12”反革命政變，大批共產黨員和革命群眾倒在血泊之中，中國革命開始轉入低潮。
為了挽救中國革命，7月下旬，中共中央決定集中共產黨所掌握的部隊首先籌劃南昌起義，爾後南下廣東，重建廣東革命根據地。同時，組成以周恩來為書記，惲代英、李立三、彭湃等為委員的中共南昌起義前敵委員會，指揮這次起義。
這時，周士第已由團參謀長升為第4軍73團團長。73團和從該團抽調骨幹組建的6個團，是中共南昌起義依靠的骨幹力量，成為南昌起義的主力之一。
8月1日晨，周士第接到第25師師長李漢魂打來的電話，要周士第去師部，說是有要事商量。
李漢魂是第4軍軍長兼第2方麵軍總指揮張發奎的親信，這時剛從廬山參加張發奎召集的反共會議回來。接到電話後，周士第非常著急，去李漢魂那裏，凶多吉少，可能影響起義的進程。如果不去見李漢魂，又會使李漢魂產生疑慮。
周士第認為，為了摸清李漢魂的意圖，同時為了穩住敵人，還是以去見李漢魂為宜。於是，周士第不顧人個安危，隻帶了1名騎兵通信員，去見李漢魂。
果不其然，見麵寒暄之後，李漢魂放低聲音直截了當地對周士第說：“總指揮很稱讚你，要重用你，希望你跟他走，不要跟共產黨走。”
周士第當即大聲地說：“第四軍在北伐中之所以能打勝仗，被譽為‘鐵軍’，張發奎之所以能有今天的地位，當了方麵軍總指揮，都是由於有共產黨的幫助，有共產黨員的英勇犧牲，你們今天跟蔣介石、汪精衛仇共、反共就是死路一條……”
談話間，周士第聽到有一列火車鳴笛從南邊開來，便知道這是起義的信號。聶榮臻曾預先通知周士第，約定南昌起義開始，立刻發一列火車北上，第25師參加起義的部隊先把輜重裝上火車運走，隨後部隊開往南昌參加起義。
周士第聽到火車鳴叫聲音，即借故走出師部，探聽南昌方麵的消息。剛一出門，周士第立刻從通信員手中拉過馬來，快馬加鞭，奔向馬回嶺團部。
聶榮臻和周士第根據上級黨的指示，共同商定了起義的具體行動計劃，決定立刻將輜重裝上火車運走，部隊隨後向馬回嶺以南的德安火車站開進。第25師共轄第73、74、75三個團，第73團是共產黨直接領導的部隊，全部參加起義；第75團雖是新組成的，但中共在這個團的基礎較好，隻是現任團長不是共產黨員，難以將團部拉出起義，由中共黨員、第1營營長孫一中串連3個營參加起義；第74團團長也不是共產黨員，這個團的工作基礎比較差，拉他們起義比較困難，隻能依靠中共黨員王爾琢把該團重機槍連拉出來。
聶榮臻、周士第商定，對比較有把握、能拉出參加起義的部隊，立即分頭通知，利用打野外的名義，將部隊拉出駐地，統歸聶、周指揮，如遇阻撓破壞起義者，堅決鎮壓；如遇追趕攔阻之敵，堅決消滅。
下午13時，參加起義部隊利用午休時間，均按計劃行動：駐黃老門西南的第75團3個營先走，駐馬回嶺以南的第74團重機槍連跟進，駐馬回嶺的第73團全部斷後。擔當後衛任務的第73團，作了隨時應急的戰鬥準備。
當第73團進到德安火車站以北時，張發奎、李漢魂等帶著張發奎的衛隊營乘火車追來。周士第立即指揮第1營對著火車猛烈射擊。張發奎見情況不妙，他所屬部隊第10、第24師已於25日開去南昌，剩下的僅第12、第25兩個師。現在第25師的兩個團又已發難，跟前隻有一個衛隊營的兵力，沒辦法，隻好跳車逃跑。跟張跳車的還有李漢魂等幾個人。
張發奎、李漢魂等跳下火車之後，列車並未停止，仍在繼續前進。此時，周士第聽到北麵有槍聲，判斷可能是敵人追來，立即率第73團第2、第3營，占領德安火車站西北端高地準備迎擊。火車開進德安火車站即被第75團包圍，車上的張發奎衛隊營還不曉得他們的總指揮張發奎已跳車逃走，仍然固執地說“沒有總指揮部的命令，決不繳槍”。
周士第以團長的名義向衛隊營營長下命令：“你們馬上繳槍！”衛隊營遂全部繳了槍。經過宣傳教育，大部分士兵和下級軍官參加了起義軍。第25師經稍加補充，即編成一個完整的師，由周士第負責帶領。
起義部隊到達德安後，火車不通了，改為步行。周士第帶第73團，聶榮臻帶第75團和第74團的重機槍連，急速連夜向南昌開進。抵達南昌城下正是第二天拂曉，天剛剛亮，和起義大部隊勝利會師。
周恩來見到聶榮臻、周士第率領著有很強戰鬥力的第25師3000多人到達南昌，非常高興地說：“你們的行動很成功！我們原來沒想到這樣順利，把第25師大部分都拉出來了。”