在結束相模方麵的憂患後，元龜三年（1572）織田信長轉戰各地攻擊反對勢力，雙方漸漸陷於精疲力竭的狀態，本願寺要求信玄打擊信長同盟家康的勢力。10月3日應與織田信長敵對的將軍足利義昭之請，信玄從甲府:躑躅崎館領起兵三萬五千餘大軍上京，目標直指京都，討伐織田信長，獲取天皇冊封

以號令天下。大軍以山縣昌景為先鋒，出兵時信玄一度感到不適，為抓住機會，大軍繼續進發。武田勝賴攻破遠江二俁城，山縣昌景也陸續攻略東三河諸城。別隊秋山信友攻破美濃岩村城。12月22日武田軍主力與德川織田聯軍在三方原交戰（史稱三方原合戰），雙方一度膠著，隨後織田的援軍部隊被武田騎馬隊突破，全軍總崩。（據傳當時家康在逃命時嚇的拉了一褲子屎尿，在逃回濱鬆城後還叫畫師畫下自己落魄的樣子，這幅畫一直掛在家康的居室內，並保存至今）家康雖逃得性命，已無力阻擋武田軍。第二年乘勝進軍陸續攻破三河諸城。信玄方麵雖然越前朝倉氏未按約出兵，但信長方麵也沒得到上杉的援助，然而在即將展開與信長一決雌雄的大戰時，信玄肺癆病突然惡化（傳說是腦溢血，一說受重傷傳說是武田信玄經常在一個地方聽見有人吹笛子，被織田信長知道而派人在那附近用鐵炮狙擊，武田信玄重傷。不過對於信玄來說這麽輕易被敵人摸清楚行蹤不太可能。有可能是織田方為了抬高織田信長的說法。）而不得不暫停上京計劃，武田軍被迫經信濃歸陣。